Experimental study on the law of rupture of pig eardrum based on free-field explosion
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摘要: 听觉系统各组成部分的机械损伤是爆炸后造成听力损失的主要原因，强脉冲声致听觉损害风险准则仍然存在许多争议，例如：指标选择冲量还是超压峰值，正压持续时间是否重要等。本研究基于自由场实爆条件，设计并搭建了大动物爆炸致伤平台，探究了不同爆炸参数对鼓膜破裂的影响规律，并建立了基于自由场超压峰值和正压持续时间的鼓膜创伤量效关系。通过笔形压力传感器测量自由场超压，通过Friedlander公式拟合超压时程曲线，确定冲击波超压峰值和正压持续时间，并对时域中记录的波形进行归一化能量频谱分析，以确定冲击波在频域上的信号能量分布。对爆炸后的小型猪进行解剖，记录不同爆炸参数下鼓膜创伤程度。以超压峰值和正压持续时间为自变量，对实验数据进行二元逻辑回归分析，并给出鼓膜破裂风险曲线。研究发现，当自由场超压峰值低于170 kPa时，鼓膜无明显损伤；当自由场超压峰值高于237 kPa时，部分鼓膜出现不同程度的破裂和充血。距爆心越近，超压峰值越大，但鼓膜创伤的严重程度并未随之单调增加。在8.0 kg TNT当量的爆炸实验中，鼓膜破裂的严重程度随爆心距的减小呈现先提高再降低的趋势。通过对冲击波载荷特征的分析可知，距爆心越近，正压持续时间越短，高频段能量占比相对更大，小型猪鼓膜破裂的概率可能反而降低，此时仍然出现显著的听力损失和耳蜗损伤。鼓膜作为通过振动传递声信号的黏弹性薄膜结构，其动力学响应可能与载荷频率成分密切相关。除了超压峰值，冲击波波形频谱分布对鼓膜破裂程度影响显著。Abstract: Mechanical damage to components of the auditory system is the main cause of hearing loss after exposure to blast overpressure waves. There still exist some controversies in high level impulse sound damage risk criteria (DRC). For example, whether average energy or peak overpressure should be used as a main criterion, whether positive duration is important or not, etc. Based on the free-field air explosion, we designed and built a platform for studying blast injuries in large animals. We studied the effect of different explosion parameters on the rupture of the tympanic membrane (TM) and created a relationship between the probability of TM rupture and the dose of the blast wave in terms of peak overpressure and positive duration. The free-field overpressure time history was measured by a pen-shaped pressure sensor. The overpressure time-history curves were fitted by the modified Friedlander equation, thus the peak pressure and positive duration of the blast wave were determined. The impulse pressure energy spectra analysis was performed on the recorded waveforms to determine the signal energy distribution over the frequencies. The degrees of TM rupture of miniature pigs were recorded after dissection under different blast conditions. A two-variable logistic regression was performed on the resulting experimental data for TM rupture risk in terms of peak overpressure and positive duration. The study found that when peak overpressure was lower than 170 kPa, there was no obvious damage to the TM; when peak overpressure was greater than 237 kPa, some of the TMs ruptured or were congested with varying severity. As the distance from the explosion center became smaller, the peak pressure became larger, while the severity of TM damage did not increase monotonically. In the 8.0-kg-TNT equivalent explosion, the severity of TM rupture showed a tendency to increase and then decrease as the distance became smaller. Through the analysis of the blast wave characteristics, we found that the smaller the distance away from the center, the shorter the positive duration and the increase in the high-frequency component of the blast wave. The probability of TM rupture of miniature pigs may decrease, but significant hearing loss and inner ear damage still occur at this time. As a viscoelastic membrane structure that transmits sound through vibration, the dynamic response of the eardrum may be closely related to the frequency spectrum of loads. In addition to the peak pressure, the blast wave waveform may have a significant impact on the degree of TM rupture.
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Key words:
- free-field explosion /
- blast wave /
- tympanic membrane rupture /
- hearing loss /
- damage risk
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21世纪以来，随着科技的快速发展及世界范围内热点地区冲突不断，爆炸性恐怖袭击、军事冲突、工业事故等所引起的爆震伤事件频频发生，爆震伤对人体健康的威胁日益凸显。眼球作为身体内最重要、复杂、脆弱的器官之一，极易受到冲击波的损伤[1-3]。由于眼球结构的特殊性，多种类型的爆震性损伤均能对其造成伤害，如：初级及三级爆震性损伤可造成眼球破裂，二级爆震性损伤可导致眼部穿通伤或贯通伤，而混合爆震性损伤还可以导致眼部烧伤。美军对战场伤亡的数据分析显示，20%的士兵在伊拉克和阿富汗战争中经历了头面部损伤，其中83.3%是由爆炸造成的[4-6]。有调查显示，爆炸冲击波可以造成眼部结构破坏，直接影响超过半数执勤人员的战斗能力。既往研究[7-9]显示，当冲击波超压峰值达到120～210 kPa时，即可引起小鼠视力显著下降，甚至失明。近年来，越来越多的研究人员开始关注爆震伤对眼部的影响及其防治策略，如何做好个体防护已成为当前研究的热点。既往研究[10]证实，无论是军事行动中还是日常生活中，90%的眼爆震伤都可通过正确佩戴个体防护装备得到有效防护。因此，外军特别是美军一直以来都非常重视执勤人员眼部防护技术的发展，陆续研制并装备了多款眼部防护产品[11-12]。2017－2018年间，美军对现有防护眼镜（主要是护目镜和风镜）进行了优化升级，同时对其冲击波防护效果进行了评估，提示佩戴防护镜可提高眼部防护能力，有效减少战斗减员[12-16]。
目前，国际上已有多个团队进行了眼部爆震伤的研究[17]，但我国对眼爆震伤的损伤机制及其防护的相关研究仍然处于初级阶段。既往虽然对视觉系统防护技术进行了一些初步研究，但对基于眼部防护产品的生物体视觉系统致伤机理和防护机制并未进行深入研究。因此，希望通过本研究深入了解爆震伤对眼部视网膜损伤的影响及机制，为防护措施和治疗策略的研究提供基础数据和理论支持。本文中，首次建立结合眼部防护设备的动物爆震伤冲击模型，同时针对爆炸冲击致生物体视觉系统防护“后效应”开展组织损伤和机能障碍改变研究，从而为防、治爆炸冲击致视觉系统损伤提供理论依据，为我国眼部防护及相关设备的研发与优化提供参考。
1. 实验方法
1.1 基于物理模型的防护产品对比测试
分别基于外场实弹实爆环境和激波管实验平台，开展眼部防护装备冲击波防护性能测试，具体实验条件描述如下。
1.1.1 外场实弹实爆环境
实验中采用7 kg TNT裸装炸药球，在距离爆炸中心3.8 m处布放仿真物理头部模型开展眼部防护装备考核评测。经初步计算[18]可知，7 kg TNT当量炸药爆炸，在3.8 m半径距离上，产生的冲击波超压峰值约为200 kPa。
1.1.2 激波管实验环境
基于中国科学院力学研究所的高温燃气激波管，构建超压峰值为100～300 kPa、持续作用时间为1～5 ms 的冲击波作用环境。
1.1.3 防护产品
本实验中，护目镜和风镜均选用市售个体防护成熟产品，具体外形结构见图1。头部测试系统与激波管实验平台已在前期工作中进行了详细介绍[19]，利用玻璃钢手糊成型、具有中国人体尺寸的头部模型作为承载平台，分别在激波管环境和外场实弹实爆环境下对眼部防护产品的冲击波防护性能进行考核并提出合理的现场防护建议措施。
1.2 BST-Ⅰ型生物激波管
采用陆军特色医学中心研制的生物激波管开展冲击致伤试验[20]。激波管全长39.0 m，由驱动段、扩张段、过渡段、试验段、消波段及附属设备、空气压缩机、高压气罐等组成，采用双夹膜结构。驱动段长1.41 m，内径为0.348 m；扩张段长1.0 m，内径为0.348～1.000 m；过渡段和试验段共长24.0 m，消波段长11.0 m，内径为1.0 m。夹膜采用4 mm × 4 mm的铝制膜片。
当激波管驱动段压力设置为3.5、4.0、4.5和5.5 MPa时，在实验动物所放置位置处，空气流场的超压峰值分别约为350、400、450和550 kPa。
为了深入了解爆震伤对眼部的具体影响，本实验中首先选用比格犬作为实验对象，模拟人体环境，初步明确爆震伤对眼部的具体影响，进而选用小鼠进行机制的研究。所有实验均经过道德伦理测试，伦理审查编号为IACUC – 20241337。
1.3 比格犬及分组
1.3.1 不同冲击波强度
雄性比格犬10只。设置激波管驱动段压力分别为3.5、4.0、4.5和5.5 MPa进行爆炸冲击致伤试验，其中4.5 MPa试验组4只比格犬，其余每组2只比格犬。试验时，试验犬1只眼睛佩戴市售风镜动物实验版进行防护（定制与试验犬眼部结构相适配的风镜外框，配套采用与上述个体防护风镜产品结构、材料完全一致的镜片产品）作为防护组，另1只眼睛呈暴露状态作为对照组。3.5、4.0和5.5 MPa组爆震伤后3 h取样，4.5 MPa组试验犬爆炸后分别在3和6 h取样。爆炸时，麻醉比格犬头部及四肢固定于特质金属架，固定方向为鼻侧朝向激波管驱动端，金属架置于距离激波管试验段末端挡板前10 cm处，末端呈封闭状态。共收集10组眼球标本，随后进行HE、Tunel与Nissl染色，观察其视网膜各层的结构改变。
1.3.2 4.5 MPa激波强度
雄性比格犬6只，设置激波管驱动段压力为4.5 MPa开展爆炸冲击致伤试验。对每只比格犬左眼进行防护，防护方法与1.3.1节中相同，于爆震伤后3 h取样。共收集6组眼球标本，随后进行HE、Tunel和Nissl染色，观察其视网膜各层的结构改变。
1.4 C57/B6J小鼠及分组
雄性C57/B6J小鼠共30只，将每只C57/B6J小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后单独放入固定笼位中，小鼠在笼中不能转身，将固定笼的方向调整为鼻侧朝向激波管驱动段，固定笼置于固定架上，并将固定架置于距离激波管试验段末端挡板前10 cm处，末端呈封闭状态。试验时，激波管驱动段压力分别设置为4.5和3.5 MPa。因小鼠头部体积过小，无法对其单眼进行有效防护，因此利用驱动段压力3.5 MPa作为防护组，4.5 MPa作为损伤组。共收集30组眼球标本，进行HE、Tunel和Nissl染色，观察其视网膜各层的结构改变。
1.5 Tunel染色
Tunel染色是一种用于检测细胞凋亡中DNA片段化的常用技术，用于实现对细胞凋亡的定性和定量分析，其分析指标包括荧光强度和细胞凋亡数目等。将比格犬和小鼠的眼球石蜡切片在二甲苯中脱蜡5～10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10 min。无系列乙醇（100%、95%、85%、75%）复水，每梯度3 min。蒸馏水浸泡2 min。滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20～37 ℃作用15～30 min。PBS洗涤3次。根据试剂盒说明书配制适当量的TUNEL检测液（碧云天，C1090），在样品上加50 μl TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min。PBS或HBSS洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
1.6 HE染色
视网膜HE染色是一种常用的组织学染色技术，用于观察视网膜组织的形态结构，其分析指标包括视网膜的层次结构、各层厚度、细胞数量和排列以及病理变化等。将比格犬和小鼠的眼球石蜡切片在二甲苯中脱蜡5～10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10min。系列乙醇（100%、95%、85%、75%）复水，每梯度3 min。蒸馏水浸泡2 min。苏木素染液染色10 min，蒸馏水洗去浮色。分化液分化10～60 s，自来水滴加或浸洗2次，每次3～5 min。置伊红染液90 s，倾去多余染色液后快速脱水。脱水，透明，封片后观察。
1.7 Nissl染色
Nissl染色是一种用于显示细胞内结构的组织学染色技术，其敏感指标包括细胞核染色、阳性细胞数、尼氏小体的形态和分布等。将比格犬和小鼠的眼球石蜡切片在二甲苯中脱蜡5～10 min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10 min。系列乙醇（100%、95%、85%、75%）复水，每梯度3 min。蒸馏水浸泡2 min。用尼氏染色液（甲苯胺蓝法）置于50～60 ℃温箱浸染20～40 min。蒸馏水漂洗切片。95%乙醇迅速分化。无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固后观察。
1.8 电镜
视网膜电镜检查多用于观察视网膜细胞的超微结构，包括自噬溶酶体等各种细胞器、吞噬泡等各类膜性结构等。将比格犬和小鼠的眼球标本在2.5%的戊二醛溶液中4 ℃固定过夜，然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用浓度为0.1 M（即0.1 mol/L）、pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用1%的锇酸溶液固定样品1～2 h；倒掉固定液，用浓度为0.1 M、pH=7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用梯度浓度（50%、70%、80%、90%和95%）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用100%的乙醇处理一次，每次20 min；最后过渡到纯丙酮处理20 min；用包埋剂与丙酮体积比为1∶1的混合液处理样品1 h；用包埋剂与丙3酮体积比为3∶1的混合液处理样品3 h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得厚度为70～90 nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min，即可在透射电镜中观察。
1.9 视觉电生理检查
提前12 h对大鼠进行暗适应，在标准暗室红光环境下，使用法国迈威视觉电生理检查仪参照ISCEV国际标准进行视觉电生理检查。具体操作步骤如下：常规麻醉（3 mL/MPa 1%戊巴比妥钠 +50 μL 50%速眠新）及复方托比卡胺滴眼液散瞳后，将麻醉好的小鼠置于电生理操作台上固定，滴入1～2滴盐酸奥布卡因滴眼液进行眼球表面麻醉，随后安放电极依次进行视网膜电图（electroretinogram, ERG）和视觉诱发电位（visual evoked potential, VEP）的检测。将ERG作用电极（Ag-Cl环状电极）放于角膜上，参考电极（不锈钢针状电极）插入小鼠脸颊皮下，接地电极（不锈钢针状电极）插入小鼠尾部皮下。VEP记录电极均为不锈钢针状电极，作用电极置于两耳连线中心皮下，参考电极和接地电极位置同ERG作用电极。ERG结果分析时选取暗适应3.0反应b波幅值、明适应3.0反应b波幅值和OPS反应的O2波幅值。VEP结果分析时选取P2波峰时值和幅值。
1.10 WB检测
取新鲜比格犬或小鼠的视网膜组织放于100 mL裂解液中，置于冰上裂解1 h，取2 μL用BCA试剂盒检测蛋白浓度，按照标准公式计算样品上样量。将25 mL 5xloading buffer加入含有脑组织的裂解液中，100 ℃水浴10 min，12 000g离心15 min，取上清用于检测。在12%的分离胶和5%的浓缩胶中进行蛋白电泳，每孔上样蛋白总量为30 μg，按恒压80和120 V分别跑浓缩胶和分离胶。恒压110 V电转至PVDF膜，5%牛血清白蛋白封闭1 h。一抗根据试剂商说明书稀释浓度用1xTBST进行稀释后4 ℃过夜。对应种属二抗孵育1 h后凝胶成像设备曝光。
1.11 数据处理
在分子生物学实验中，每只小鼠进行3次技术重复实验，并对数据求平均值。每组的3个平均值用于组间统计比较。
在病理实验中，每组3只小鼠的一个切片在免疫荧光激光共聚焦显微镜下观察，从每个切片中随机选择3个视野以定量检测指标，并对数据进行平均。每组得到的3个平均值用于组间统计比较。
1.12 统计学分析
统计分析采用Prism软件9.0版。每组的所有值均以平均值±标准差表示。根据方差的齐性，选择使用参数和非参数检验。根据不同的比较情况，使用Student t检验或单因素方差分析以及Sidak或Turkey的多重比较检验来分析统计差异。P<0.05表明差异有统计学意义。
2. 实验结果与分析
2.1 基于物理模型的防护产品对比测试结果分析
2.1.1 激波管测试环境
太阳镜和风镜的防护性能测试实验装置如图2所示，对照组为无眼部防护装备（裸头模）。图3为了3种不同防护状态下的实验结果。由图3(a)可知，在裸头模、佩戴太阳镜和风镜的测试条件下，喷管出口处传感器测试3次试验所得冲击波波形基本一致，超压峰值分别为192、203和206 kPa。所有数据至少重复测量3次。对比3种不同状态头模测试结果可知（图3(b)），佩戴太阳镜和风镜可实现对眼部的有效防护，超压峰值分别由397 kPa下降至约311和166 kPa，且风镜的防护效果更佳。
图 2 太阳镜和风镜的防护性能测试实验装置Figure 2. Experimental devices for testing protective performances tof sun glasses and goggles
图 3 3种不同防护条件下的激波管管口和头模眼部超压-时间曲线Figure 3. Overpressure-time curves of the mouth of the shock tube and the eyes of the head models under three different protection conditions2.1.2 外场实弹实爆环境
图4为在外场实弹实爆考核测试环境下，裸头模、佩戴太阳镜和风镜头模的防护性能测试结果。其中，图4(a)为自由场所测超压-时间（Δp-t）曲线，图4(b)为裸头模、佩戴护目镜和风镜头模所测超压-时间（Δp-t）曲线。由图4可知，佩戴太阳镜和风镜可有效保护执勤人员眼部免受爆炸冲击伤害，且风镜的防护效果明显优于护目镜。与裸头模相比，佩戴护目镜后，头模眼部爆炸冲击波超压峰值下降72.2%，佩戴风镜后下降约80%，该测试结果与激波管测试结果一致。所有数据至少重复测量3次。因此，结合实际训练、演训情况，建议给执勤人员队配发兼容防紫外、强光、烟雾和防破片功能的风镜防护产品。
图 4 3种不同防护条件下的自由场和头模眼部超压-时间曲线Figure 4. Overpressure-time curves of the free field and the eyes of the head models under three different protection conditions2.2 生物体防护效应分析
本研究中同时选用比格犬和小鼠建立了动物爆炸冲击波损伤模型。比格犬在生理结构、代谢途径和遗传背景等方面与人类更接近；且大动物模型可以模拟爆炸冲击波损伤的复杂性和多样性，可更深入地研究疾病的发病机制、病理变化、疾病进程以及防治措施。为使实验结果更具有真实性和可靠性，选用小鼠建立爆炸冲击波损伤模型进行结果验证。
2.2.1 爆炸冲击波对比格犬视网膜病理形态学的影响
为了观察爆炸冲击波对比格犬视网膜病理形态学的影响，本研究中采用了HE染色法（图5）。与防护组相比，损伤组的视网膜神经纤维层（retinal nerve fiber layer，RNFL）和内外核层（inner nuclear layer/outer nuclear layer，INL/ONL）厚度均减小（图6）。其中，INL厚度减小最显著，提示其可能对冲击波损伤最敏感。试验结果同时提示，视网膜损伤程度与冲击波强度正相关。但值得注意的是，5.5 MPa组视网膜损伤程度最低，不排除与动物个体差异相关。同时，3.5 MPa组与其他组相比，防护前后视网膜厚度差异最大，可知该强度下防护发挥了最大的保护作用。5.5 MPa组视网膜厚度差异最小，由于实验犬数量有限，不除外与实验动物个体差异性有关，因此进一步选用雄性C57/B6J小鼠进行了相关实验的验证。
图 5 不同激波强度下防护组与损伤组视网膜HE染色结果Figure 5. Retinal HE staining results of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 6 不同激波强度下样本平均INL和ONL厚度Figure 6. Mean INL and ONL thickness of the samples under different shock wave intensitiesHE结果（图7）显示，防护组的RNFL、INL和ONL厚度均大于损伤组，说明市售风镜动物实验版可有效减轻冲击波对视网膜的损伤。此外，在4.5 MPa测试条件下，与冲击波损伤3 h相比，6 h实验组的INL和ONL组织较厚，如图8(a)～(b)所示，提示可能在急性损伤后，视网膜有一定程度的恢复。此外，分别计算了3 h实验组和6 h实验组的INL/ONL比值（图8(c)），发现该比值随着时间的推移而增大，且损伤组的增大幅度更大。这是由于INL相对于ONL具有更快的恢复能力。
图 7 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组视网膜HE染色结果Figure 7. Retinal HE staining results of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times
图 8 4.5 MPa激波下，不同取样时间样本平均INL和ONL厚度以及两者的比Figure 8. Mean INL and ONL thicknesses of the samples and their ratio under 4.5-MPa shock wave at different sampling times为了检测冲击波对视网膜细胞凋亡的影响，采用Tunel染色法，将凋亡细胞标记为绿色荧光（图9～10）。由图9可以看出，在不同强度的冲击波损伤后，损伤组的RNFL、INL和ONL厚度均低于防护组，说明防护措施有效地保护了视网膜细胞免受凋亡。在各个视网膜层中，发现光感受器内外节交界处（inner segment/outer segment，IS/OS）的凋亡信号最强烈，表明光感受器细胞（photoreceptor）可能对冲击波损伤最敏感靶点，凋亡细胞最多。进一步测量IS/OS层的厚度（图11），分析发现，经过不同强度的冲击波损伤后，损伤组IS/OS层的厚度小于防护组。这说明冲击波可能导致了IS/OS层细胞的凋亡。其中，3.5 MPa损伤组IS/OS层与防护组相比，差异最显著，推测在该强度下视网膜防护措施发挥了最大的作用。
图 9 不同激波强度下防护组与损伤组视网膜Tunel染色结果Figure 9. Retinal Tunel staining results of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 10 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组视网膜Tunel染色结果Figure 10. Retinal Tunel staining results of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times
图 11 不同激波强度下样本IS/OS厚度和Figure 11. Sum of IS and OS thickness of the samples under different shock wave intensities对4.5 MPa测试条件下爆炸后不同时间点的防护组和损伤组的IS/OS厚度（图10）进行了测量和统计分析，结果（图12）显示，该值随着时间的推移而增大，表明感光细胞整体有一定的恢复能力。相比于损伤组，防护组的IS/OS值增大更明显，说明实验防护措施的保护作用不仅体现在直接降低视网膜的损伤程度，也体现在保护视网膜的修复潜力。
图 12 4.5 MPa激波下，不同取样时间样本IS/OS厚度和Figure 12. Sum of IS and OS thickness of the samples under 4.5-MPa shock wave at different sampling times2.2.2 爆炸冲击波对比格犬视网膜RGCs的影响
HE染色结果（图5和7）显示，冲击波损伤后3 h与6 h组RNFL厚度没有明显变化，提示冲击波会对RNFL造成的不可逆损伤，可能与视网膜神经节细胞不可再生的特征相关。使用与通过视乳头相邻的切片，以尽量减少视网膜厚度和位置的变化。对每只动物至少有2个切片的计数取平均值。每张染色切片自视乳头起，于50×放大倍数平均取8个区域，定义为单位视野。对单位视野下视网膜中RGC数量进行统计，该结果与损伤组单位视野下的RGC数量减少相吻合（图13），说明冲击波对神经节细胞层及其突触均造成了一定损伤。同时，也发现在4.5 MPa测试条件下，相对3 h实验组而言，6 h实验组RGC的数量并不会随着爆炸后时间的延长而恢复，而是呈现稳定的状态（图14），与RNFL厚度的变化趋势相似。这可能是由于RGC及其轴突对冲击波损伤的修复能力较差，或者是其损伤机制与其他细胞不同导致。
图 13 不同激波强度下防护组与损伤组RGC细胞数Figure 13. RGC count of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 14 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组RGC细胞数Figure 14. RGC count of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times通过Tunel染色法，对不同强度冲击波损伤后，各组视网膜单位视野下RGC的凋亡数量进行了量化（图15），发现不同激波强度下，损伤组的RGC凋亡数量均显著大于防护组（P < 0.001），说明防护措施对RGC层具有较强的保护能力。对4.5 MPa测试条件下爆炸后不同时间点的防护组和损伤组单位视野下各组RGC的凋亡数量进行了量化（图16），结果显示，相比于损伤组，防护组RGC的凋亡数量随时间变化更显著（P =
0.0003 ），凋亡细胞数目逐渐减少趋于正常值，这也表明防护措施不仅可以减弱冲击波对视网膜细胞的即时损伤，还在一定程度上稳定了视网膜细胞的保护和修复能力。还对单位视野下各组凋亡细胞总数进行了量化（图17），结果显示，不同激波强度下，损伤组的细胞凋亡总数均大于防护组，说明防护措施在整体上对视网膜全层起到了防护作用。
图 15 不同激波强度下，防护组与损伤组单位视野下RGC凋亡数量Figure 15. Apoptotic number of RGCs in unit field of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 16 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组单位视野下RGC凋亡数量Figure 16. Apoptotic number of RGCs in unit field of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times
图 17 不同激波强度下，防护组与损伤组单位视野下凋亡细胞数量Figure 17. Apoptotic number of cells in unit field of the protection group and the injury group under different shock wave intensities为了进一步检测冲击波对RGC损伤情况的影响，采用了Nissl染色法，结果如图18～19所示，可以发现：在不同强度的冲击波损伤后，与损伤组相比，防护组的神经节细胞层（ganglion cell layer, GCL）厚度均大于损伤组，这与之前HE染色的结果一致。统计了单位视野下视网膜GCL的阳性细胞数，结果如图20所示，可以看出，不同激波条件下，防护组的阳性细胞数均少于损伤组。同时，对4.5 MPa测试条件下爆炸后不同时间点的防护组和损伤组的阳性细胞数进行统计，结果如图21所示，可以看出，损伤组与防护组的阳性细胞数均随时间减少趋于正常值（P < 0.05）。这说明防护措施对RGC具有一定的保护作用。
图 18 不同激波强度下防护组与损伤组视网膜Nissl染色结果Figure 18. Retinal Nissl staining results of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 19 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组视网膜Nissl染色结果Figure 19. Retinal Nissl staining results of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times
图 20 不同激波强度下，防护组与损伤组单位视野下阳性细胞数Figure 20. Number of positive cells in unit field of the protection group and the injury group under different shock wave intensities
图 21 4.5 MPa激波下，不同取样时间防护组与损伤组单位视野下阳性细胞数Figure 21. Number of positive cells in unit field of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave at different sampling times2.2.3 4.5 MPa激波下，爆炸冲击波对比格犬视网膜的影响
为了进一步提升实验结论的真实性与可靠性，在4.5 MPa测试条件下开展了后续实验。HE染色结果（图22）显示，保护组的INL厚度与ONL厚度都明显大于防护组（图23，df为自由度）。对单位视野下视网膜中RGC数量进行统计（图24(a)），损伤组中的RGC数目明显小于防护组。Nissl染色结果（图22）显示，损伤组单位视野下视网膜GCL的阳性细胞数大于防护组（图24(b)）。差异均具有统计学意义。
图 22 4.5 MPa激波下，防护组与损伤组视网膜HE和Nissl染色结果Figure 22. Retinal HE staining and Nissl staining results of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave intensities
图 23 4.5 MPa激波下，样本平均INL和ONL厚度Figure 23. Mean INL and ONL thicknesses of the samples under 4.5-MPa shock wave intensities
图 24 4.5 MPa激波下，防护组与损伤组单位视野下RGC细胞数Figure 24. RGC and positive cell count in unit field of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave intensityTunel检测结果（图25）显示，防护组中视网膜的GCL层凋亡细胞数量相比较损伤组显著下降。
图 25 4.5 MPa激波下，防护组与损伤组视网膜Tunel检测结果Figure 25. Retinal Tunel test results of the protection group and the injury group under 4.5-MPa shock wave intensity2.2.4 爆炸冲击波对小鼠视网膜病理形态学的影响
在小鼠冲击波损伤后第3天，对防护组和损伤组小鼠视网膜组织进行了相关指标的检测，检测结果如图26所示。HE和Nissl染色结果显示损伤组小鼠的视网膜中，内网层（inner plexiform layer, IPL）、INL、外网层（outer plexiform layer, OPL）以及ONL细胞厚度明显小于防护组，防护组的小鼠总体视网膜厚度大于损伤组，差异具有统计学意义，提示市售风镜动物实验版能有效保护视网膜。
图 26 防护组和损伤组视网膜的HE染色和Nissl染色结果以及各组视网膜厚度量化结果Figure 26. Retinal HE and Nissl staining results of the protection group and the injury group as well as quantitative results of retinal thickness in each group2.2.5 爆炸冲击波对小鼠视网膜细胞凋亡的影响
Tunel检测结果显示，防护组中视网膜的GCL层凋亡细胞数量相比较损伤组显著下降（P =
0.0018 ），如图27所示。而视网膜中INL、ONL、IPL、OPL及色素上皮层（retinal pigment epithelium layer）中的凋亡细胞未观察到组间差异。该结果可能与RGC细胞及其轴突不可再生相关，而视网膜其他细胞可能在损伤后存在修复可能。
图 27 防护组和损伤组视网膜的凋亡检测以及视网膜GCL凋亡细胞量化结果Figure 27. Apoptosis detection in the retina of the protection group and the injury group as well as quantitative results of apoptotic cells in the retinal RGC layer2.2.6 爆炸冲击波对小鼠视网膜视觉功能的影响
对小鼠3 d后的视觉电生理进行了检查，发现防护组Ops中的O2幅值增加（P =
0.0074 ）（图28），表明防护组的视网膜内层功能状态改善；VEP的潜伏期缩短（P =0.0126 ）（图29(a)～(b)）以及VEP中的P2幅值增加（P =0.0249 ）（图29(c)），表明防护组视觉通路健康状况改善；与损伤组相比差异具有统计学意义，说明防护组的小鼠视觉功能明显优于损伤组小鼠。
图 28 视觉电生理检查各组Ops数据以及Ops指标中O2幅值量化Figure 28. Ops data of each group measured by visual electrophysiology as well as quantification of O2 amplitude in Ops indices
图 29 视觉电生理检查各组VEP数据以及VEP指标中潜伏期量化和P2幅值量化Figure 29. VEP data of each group measured by visual electrophysiology as well as quantifications of latency and P2 amplitude in VEP indices2.2.7 爆炸冲击波对小鼠视网膜细胞自噬情况的影响
此外，还通过电镜技术进一步检测了损伤后视网膜细胞中的自噬情况，发现与防护组比较，损伤组RGC中胞浆成分已降解的单层膜自噬溶酶体和有包绕胞浆成分的多层膜吞噬泡数量明显增多（图30），该结构为细胞自噬后形成，其数量可以用来衡量细胞内自噬现象的程度；自噬相关调节蛋白SQSTM1/p62（P <
0.0001 ）和LC3-Ⅱ （P =0.8437 )、LC3-Ⅰ （P = 0.003）的表达量明显增高，差异具有统计学意义（图31～32，图32(b)中ns表示不显著）。SQSTM1/p62和LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达量变化反映了细胞自噬活动的状态。在自噬活性正常时，SQSTM1/p62和LC3-Ⅱ的水平会受到调控，不会异常积累。而在自噬过程受阻或增强时，这些蛋白的表达量可能会上升，从而影响细胞内环境的稳定。提示冲击波损伤可以造成视网膜细胞自噬，同时与防护组比较，损伤组中小鼠的RGC自噬现象增强，防护组视功能较好可能与防护后RGC自噬程度较低相关。
图 30 透射电镜检测各组RGC中自噬情况Figure 30. Transmission electron microscopy detection of autophagy in the retina of each group
图 31 WB检测各组中自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表达水平Figure 31. WB detection of autophagy-related proteins SQSTM1/p62, LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ expression levels in each group
图 32 SQSTM1/p62、LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ相对表达量量化Figure 32. Quantification of SQSTM1/p62, LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ relative expression levels3. 讨 论
作为重要的单兵防护装备，军用眼镜能有效抵御战场强光、沙尘、破片等多重威胁，更重要的是，军用眼镜作为眼部爆震伤的防护装置，已经在世界范围内得到了广泛使用。为了评估防护产品对眼部的防护能力及其防护机制，本实验中采用陆军特色医学中心研制的BST-Ⅰ型生物激波管，该激波管具有工作效能高、损伤程度可控等优势，可有效制作眼部爆震伤模型[19, 21-23]，同时分别选用比格犬和小鼠作为被试动物，对市售护目镜和风镜两款防护产品进行抗冲击波防护性能测试，对其防护性能进行对比分析。研究发现，对于眼部爆震伤的防护，风镜的防护性能更优，其可能通过减少爆震波对眼部的直接冲击力、缓和压力波的冲击，保护眼部免受伤害。
本研究使用的市售风镜动物实验版，其特点是能够全包围眼部区域，避免爆炸波从间隙处进入，并且能够缓冲爆炸波对眼部的冲击。在本模型中，爆震伤虽然未对眼部外形未造成严重伤害，但对视网膜的结构造成了显著影响，影响了眼部功能。实验结果显示，该防护眼镜能够显著降低爆炸波对视网膜神经元的损伤程度，尤其是对GCL的保护效果最明显。同时，随着冲击波强度的提高和爆炸后时间的延长，视网膜组织中其他多种细胞及结构均受损，细胞凋亡程度均提高，其中GCL和IS/OS受到的损伤最严重；而视网膜细胞也出现了较严重的自噬现象。此外，相比其他组，在3.5 MPa测试条件下的损伤组视网膜厚度和细胞凋亡程度差异最显著，推测该强度下防护风镜发挥了最大的保护作用，可能与防护组视网膜细胞自噬减少相关。
推测该防护风镜可能通过以下机制实现其保护作用：(1)通过吸收、分散和减少冲击能量，减少爆炸波对眼部区域的直接冲击作用，缓冲爆炸波对眼球表面的冲击力；(2)降低爆炸超压对眼球内部结构的损伤，减轻视网膜各层的损伤；(3)阻止爆炸波从眼周缝隙处进入眼球内部，避免视网膜缺血、缺氧和继发性损伤。这在我们的实验中可以看出，市售风镜动物实验版能有效地减轻冲击波对视网膜的损伤，保护RGC、RNFL、INL/ONL、GCL和IS/OS层结构的完整性和功能。
本实验结果显示，冲击波损伤眼部后，视网膜感光细胞层出现了较明显的病理改变。我们发现，当色素上皮完整性丧失、视紫红质的缺失与错定位和锥体细胞严重受损时，会出现与本实验类似的Tunel染色结果[24]。根据以往的研究，光感受器内段含有大量线粒体，视网膜超微结构改变显示，爆震伤后0.5 h，光感受器细胞的内节线粒体出现肿胀变性，外节盘膜也呈现紊乱、稀疏的状态。所以可以推测，IS/OS层检测到的高荧光强度很可能与线粒体的变化有关。结合本次小鼠实验，发现损伤组胞浆成分已降解的单层膜自噬溶酶体和有包绕胞浆成分的多层膜吞噬泡数量明显增多；同时自噬相关调节蛋白SQSTM1/p62和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达量明显降低。这表明爆炸冲击波可造成视网膜中以IS/OS层为主的线粒体自噬现象增强。色素上皮层富含色素于抗氧化剂，具有保护和抗氧化功能。并且色素上皮层中的线粒体氧化应激可导致色素上皮层和视网膜光感受器的代谢功能障碍[25]。所以，可以推测爆炸冲击波也作用于色素上皮层导致其氧化应激，进而促进IS/OS层的线粒体自噬现象。
本研究虽然取得了一定成果，但仍有不足之处，需要继续在今后的工作中改进。首先，本研究的实验动物主要是以小型哺乳动物，如鼠类为主，而人类与之在生理结构和反应机制上存在差异。本研究的实验结果可能无法完全套用到人类身上，因此需要进一步对人类研究进行实证支持。此外，爆震对眼部的损伤程度也会受到实验环境、爆炸距离、动物的身体状况等多种因素的影响。这些因素的变化可能会对实验结果产生影响。这方面的未尽之处也需要在未来的研究中得到改善和完善。其次，本研究主要关注的是外界压力对眼球结构的影响，但并未深入研究爆震伤对视功能的影响。另外，本研究主要关注的是爆震创伤及影响，而对于创伤后的康复过程和治疗方法并未详细探讨。对于如何提高爆震伤康复的效率，如何降低爆震对眼部的长期影响等问题值得在未来的研究中深入探讨。总之，虽然本研究取得了一定的进展，但仍有许多未尽之处需在未来的研究中继续深入。因此，今后的工作中需要从更多的角度和指标来系统性评价防护眼镜对冲击波的防护作用，并对其进行更全面的优化和改进，以提高其防护性能和适应性能，为爆震伤眼部防护和创伤恢复提供更多更准确的科学依据。
4. 结 论
首先，基于头部动态测试系统与激波管和外场实弹实爆测试环境，验证了护目镜和风镜的防护性能。研究表明，风镜防护冲击波的性能更优，建议给执勤人员配发兼容防紫外、强光、烟雾和防破片功能的风镜产品，以提高相关人员眼部防护能力。然后，探索了视觉系统组织损伤和机能障碍改变及市售风镜动物实验版的防护作用与机制，选用比格犬和C57BL/6J小鼠开展了相关动物实验，通过BST-I型生物激波管制模后，采用病理、视觉电生理检查等测试方法，探究了冲击波伤后视网膜病理和功能改变，发现爆炸后视网膜损伤和细胞凋亡程度均提高，其中GCL和IS/OS受到的损伤最严重；视网膜细胞自噬现象较重。市售风镜动物实验版能够有效地减轻冲击波对视网膜的损伤，保护视网膜各层结构的完整性。同时，与其他组相比，3.5 MPa强度下的实验组视网膜厚度和细胞凋亡程度差异最显著，推测该强度下防护眼镜发挥了最大的保护作用，可能与在防护作用下RGC自噬现象降低有关。尽管，目前已经取得了一些关于眼部爆震伤损伤机制的重要突破，但仍然需要进一步的研究。随着技术的发展，期待未来能够采用更安全有效的防护设备和治疗手段，最终减少爆震伤对人体眼部的危害。
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图 1 实验中小型猪及压力传感器的布放示意图
Figure 1. Layout diagrams of experimental minipigs and pressure sensors
图 3 1.9 kg TNT当量爆炸距离爆心1.8 m处的实测自由场超压时程曲线以及用Friedlander方程拟合的结果
Figure 3. Measured free-field overpressure-time histories at a distance of 1.8 m away from the explosion center of the1.9-kg-TNT equivalent explosion and the fitting result with the Friedlander equation
图 4 1.9 kg TNT当量爆炸条件下的距离拟合曲线
Figure 4. Distance-peak pressure and -positive pressure duration fitting curves under 1.9-kg-TNT-equivalent explosion condition
图 5 8.0 kg TNT当量爆炸条件下的距离拟合曲线
Figure 5. Distance-peak pressure and -positive pressure duration fitting curves under 8.0-kg-TNT-equivalent explosion condition
图 6 不同爆炸条件下不同爆心距处的归一化能量频谱
Figure 6. Normalized energy flux over 11 frequency bands from below 62.5 Hz to above 16 kHz at different distances away from the explosion centers under different explosion conditions
图 8 通过逻辑回归得到的冲击波致小型猪鼓膜破裂概率函数
Figure 8. Logistic regression calculated probability of TM rupture of minipigs caused by blast waves
图 9 冲击波致小型猪鼓膜破裂风险曲线
Figure 9. Risk curves of TM rupture of minipigs caused by blast waves
图 10 8.0 kg TNT当量爆炸条件下距爆心2.9 m处小型猪爆炸前后听力功能的改变以及爆炸后耳蜗毛细胞的形态
Figure 10. Hearing function changes of minipigs at a distance of 2.9 m away from the explosion center of 8.0-kg-TNT-equivalent explosion and hair cell morphology of the cochlea after explosion
表 1 不同爆炸条件下鼓膜创伤率及小型猪致死率
Table 1. Eardum trauma ratios and mortality ratios of minipigs under different explosion conditions
炸药当量/kg 爆心距/m 超压峰值/kPa 正压持续时间/ms 创伤率/% 致死率/% 鼓膜破裂 鼓膜充血 鼓膜无损 1.9 1.8 511.59±30.68 1.40±0.15 25 25 50 0 2.6 169.97±4.19 2.80±0.01 0 0 100 0 3.2 96.30±1.38 4.65±0.14 0 0 100 0 8.0 2.6* 628.28 1.30 0 25 75 50 2.9 528.74 2.11 0 100 0 0 3.2 378.51±38.57 2.98±0.14 100 0 0 0 3.8 237.01±15.46 4.26±0.10 50 25 0 0 4.6 142.13±1.32 5.69±0.11 5.5 100.43 6.63 注：*8.0 kg TNT当量爆炸条件下距爆心2.6 m处的载荷数据由其他距离参数推算而得。 
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